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关于-一种利用高温酯酶TTEST去除废纸浆中胶黏物的方法复审一案成功

发布时间:2019/3/29    来源:本站

国家知识产权局于20180830日发出关于申请号为201610727345.6,申请日为20160826日,名称为一种利用高温酯酶TTEST去除废纸浆中胶黏物的方法的发明专利的驳回决定。

东方盛凡于20181116日受到客户委托对其进行复审,东方盛凡迅速对该案件进行了分析、讨论,并撰写了复审请求书,于20181211日提交至复审委员会。

2019年0111日,东方盛凡收到专利复审委员会做出的撤销驳回决定的复审决定书,并于2019225日收到国知局发出的第三次审查意见通知书,指出权利要求书中关于浓度的表述中存在“()”导致权利要求书不清楚,经东方盛凡对权利要求书中的“()”进行删除修改,与2019315日重新提交修改后的权利要求书,目前案件正在进一步审查中。

该案件自收到客户委托至撤销驳回决定仅仅花费了1个月的时间,充分展现了东方盛凡的不俗实力。

以下为该案件具体详情:

涉案撤销驳回决定时的权利要求书如下:

1 .一种利用高温酯酶TTEST去除废纸浆中胶黏物的方法,其特征在于包括如下步骤:

酯酶TTEST的制备过程:利用全基因合成方法获取的TTEST酯酶的编码基因,并克隆到表达载体pET23a-CBD载体上获得重组表达载体,利用CaCl2转化法,将含有TTEST酯酶编码基因的表达质粒转入BL21/DE3菌种中,获得基因工程菌,将酯酶TTEST的菌种接到含Amp 100ug/mlLB种子培养基中扩大培养,当OD值达到0.60.8时加入20mmol/LIPTG诱导剂进行诱导表达,1824h后收菌,将菌液在12000r/min条件下离心10min后收集管壁细胞进行超声破碎,之后再以12000r/min条件离心10min后取上清液,即得到粗酶液;1L菌液对应1g纤维素,常温下将粗酶液与纤维素结合30min,适时搅拌;结合后高速离心10min,弃去上清液,将吸附蛋白用PBS缓冲液洗两次;3C蛋白酶在使用前先离心、弃去上清,利用PBS缓冲液清洗2次;向吸附蛋白中加入适量PBS,按1L菌液对应1ml 3C蛋白酶的比例混匀后酶切4h或过夜;酶切后高速离心,上清液即为纯酶;酯酶TTEST的氨基酸序列如SEQ ID NO2所示;

称取100gOCC绝干浆,稀释浆浓至6%,酯酶TTEST添加量为相对于绝干浆质量1.0U/g,处理温度为80℃,pH9.0,处理时间60min,搅拌转速为150rpm

代理人在复审请求书中认为,权利要求1与对比文件1相比至少有如下的区别技术特征:

权利要求1所用酯酶为TTEST酯酶并公开了其制备方法,处理废纸浆温度为80℃,pH为9.0。

基于上述区别技术特征,修改后的权利要求1相对于对比文件1实际要解决的技术问题是:提供一种可以在极端环境下有效去除废纸浆中胶黏物的酯酶TTEST及其制备方法

对比文件1中的酯酶在能够保持较高活性的60℃下,其胶黏物去除率也仅在20%-40%,同样本申请说明书【0038】对比实施例1中脂肪酶CALB在具有很高活性的40,PH6.0良好环境下胶黏物去除率也仅仅为37.4%。由此可得,即使在能够使生物酶保持良好生物活性的温度环境下,其胶黏物的去除率结果也并不足以让人满意。究其原因,不管是耐高温的生物酶还是普通生物酶,其高效、专一、稳定的催化性能往往需要在母体细胞的环境下才能够得以充分的实现,在离体的条件下,其极易受各种物理或化学因素的影响而导致稳定性差、催化效率低甚至丧失活性,本申请中生物酶的催化环境废纸浆成分极其复杂,含有大量能够使生物酶失活的化学物质,酯酶在复杂的纸浆环境介质中进行酯交换和酯化反应合成酯,使用过程因各种物理或化学因素导致大量的生物酶稳定性差、催化效率低甚至丧失活性;

综上,导致废纸浆中胶黏物去除率不高的原因有两方面:

①废纸处理过程中温度很高,高温使普通生物酶无法适应较高的温度而失活;

②含有大量能够使生物酶失活的化学物质的成分的极其复杂的废纸浆导致离体的生物酶稳定性差、催化效率低甚至丧失活性。

所以,即使对比文件2公开了本申请的高温酶的氨基酸序列号,本领域技术人员想到将对比文件2与对比文件1相结合,利用耐高温酶来去除废纸浆中的胶黏物,其也只是提高了酶的耐受温度,即解决了由于①而导致的胶黏物去除率不高的问题,其同样还遇到上述②而导致废纸浆中胶黏物去除率不高的问题。所以对比文件1同对比文件2相结合,胶黏物去除率有可能由原本的2.4%(数据来源:本申请实施对比例3)这样极低效率有一定的提升,但是由于原因②问题的存在,其结果较现有常温20-40%的除胶率并不会有更大的提升。问题②是本领域技术人员一个亟待解决的问题。

而且对比文件2所公开的提取方法为从嗜热微生物生存的特殊高温环境中分离嗜热菌,然后从嗜热菌中纯化得到耐热酶,然而,大多数嗜热菌生长速度缓慢,培养条件严格,因此通过对比文件2的方法来获得大量耐热酶也及其困难,此为对比文件1和对比文件2相结合的问题③。

针对上述问题:

本申请发明人利用全基因合成方法获取TTEST酯酶的编码基因,并克隆到表达载体pET23a-CBD上获得重组表达载体。利用CaCl2转化法,将含有TTEST酯酶编码基因的表达质粒转入BL21(DE3)菌种中,获得基因工程菌,然后在一定的条件下对其进一步扩大培养得到粗酶液,并进一步纯化得到纯酶,克服了对比文件1同对比文件2相结合的问题③;更重要的,本申请将得到的粗酶液加入纤维素,常温下将粗酶和纤维素结合30min,纤维素具有很强的物理吸附作用力,从而纤维素和酯酶能很好的结合在一起,得到酯酶/纤维素的结合体,而纤维素是细胞壁的主要结构成分,从而为脱离母体细胞的酯酶提供了一个类似于母体细胞的载体,极大的增强了其化学稳定性,废纸浆中又含有大量的纤维素,由于在培养过程中酯酶对纤维素产生了很好的生物亲和力,酯酶加入废纸浆中后能很好的与纤维素融合在一起,提高其抗化学侵害的能力,促进酶更好的发挥其催化活性,从而解决了问题②,使酯酶TTEST80℃高温和PH9.0强碱环境下和含有大量能够使生物酶失活的化学物质的废纸浆中,仍能保持极大的生物催化活性,具备高效的除胶黏物的能力,胶黏物去除率达到54.7%,明显优于现有现有技术的20%-40%的胶黏物去除率。

本申请利用全基因法合成方法获取耐高温的TTEST酯酶的编码基因,并进一步培养制得粗酶,然后将酯酶与纤维素进行特异性结合,产生亲和力,在纯化的同时对酯酶进行进一步改进,为游离的酯酶提供一个类似于母体细胞的载体,增强其化学稳定性,从而克服了现有技术存在的问题①②,同时克服了对比文件1和对比文件2相结合的问题③,这一系列的操作不是本领域技术人员通过对比文件1和对比文件2就能简单得出的,同时本申请技术方案的胶黏物去除率明显优于将对比文件1和对比文件2相结合利用高温酶代替普通酯酶去除废纸浆中的胶黏物去除率,存在很大的技术进步。其结果也并非本领域技术人员在对比文件1结合对比文件2的基础上能够显而易见的得出的。申请人对此付出了创造性的劳动。

综上,对比文件1的基础上结合对比文件2不能得到本申请,所以,修改后的权利要求1对于本领域技术人员是非显而易见的,具有突出的实质性特点。

东方盛凡团队在本案复审的处理过程中,针对涉案专利创造性的委托,迅速采取行动并取得复审程序的速胜,保障了客户的合法权益,获得案件的全面胜利!

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